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一、何謂RNAi？
　　RNAi為RNA interference（RNA干擾）的簡稱，是一種可造成RNA降解（RNA degradation）進而導致該RNA分子失去功能的一種作用，此作用係透過小片段之RNA分子（約20~25 核?酸，稱為small interfering RNA，簡稱siRNA）結合到與其序列互補之RNA上，形成雙股RNA，引發連串雙股RNA分解與合成放大作用，造成該特定基因失去功能。RNAi亦可稱為轉錄後基因靜默作用（post transcriptional gene silencing, PTGS），係因RNAi作用於基因轉錄為mRNA後，透過降解作用，使得mRNA無法轉譯成蛋白質，而產生該基因靜默現象。此現象目前已廣泛應用於功能性基因體學（Functional Genomics）之研究，利用小片段的siRNA先將特定基因的RNA加以破壞，再由其破壞後所造成的結果，去推估該特定基因的功能。對於常謂"無藥可醫"的病毒病害，RNAi是目前新興且被熱衷研究的防治方法之一，國內外許多研究團隊目前正積極研究應用RNAi作用專一性的破壞病毒基因，以達到防治病害目的之可能性，並已獲得豐碩的成果。而科學界權威期刊"Science"在2002年將RNAi技術選為年度科技（Technology of the Year），RNAi科技的重要性與熱門程度由此可見一斑。預期此技術將在基因體學研究、病毒病害防治等各種生物相關科學上發揮突破性之貢獻。

二、RNAi 的發現簡史
　　RNAi的現象早在1990年就已被報導，當時Rich Jorgensen及A. R. Stuitji二個研究團隊將查爾酮（chalcone）合成酵素的基因轉殖於矮牽牛（petunia）中，期望藉由增加一套查爾酮合成酵素基因，產生花色更紫、更鮮豔的植株，但結果卻發現不但多一套的基因沒有表現，原本存在的那一套基因反而也失去了功能，此現象當時稱為"共同抑制（co-suppression）"，且被認為是矮牽牛中特異的現象。之後，此現象也陸續在其他真核生物系統中被發現到，如1992年針對紅麵包黴菌（Neurospora crassa）所做之研究報告指出其將albino-3 (al-3)與albino-1 (al-1)基因轉殖後，卻造成原有基因功能破壞而引起白化現象，但此作用在真菌研究領域中稱為"壓制"（quelling）；1993年則發現菸草蝕刻病毒（Tobacco etch virus, TEV）在轉基因抗病植物中亦可造成基因靜默現象而達到抗病的目的，此現象在植物病毒研究中稱為轉錄後基因靜默作用（PTGS）。而後在1998年於線蟲Caenorhabditis elegans上也發現這種RNA干擾現象，並首度被稱為RNAi。在此發現歷程中，從事不同研究領域的科學家所發現這些現象的本質與分子機制其實均是相同的，但由於RNAi這個名詞簡短有力又兼可顧名思義，因而漸漸的都將此現象稱為RNAi，並成為目前生物相關科學研究中最熱門的名詞之一。

三、RNAi與植物病毒之研究
　　植物病毒的研究對於RNAi現象分子機制之了解具有極大的貢獻。早於1985年，Sanford與Johnston二位學者就已經提出"病原體衍生抗病性（pathogen derived resistance, PDR）"的觀念，證實藉由轉殖病毒基因體於植物中可以使得植物產生對於該病毒的抗病性，但當時並不知道其背後的分子機制即為RNAi。而後陸續發現菸草嵌紋病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）、菸草蝕刻病毒等病毒外鞘蛋白基因可用於轉殖植物而誘發對於該病毒的抗性，接著又發現其實不需要整個基因或完整蛋白之表達，僅需一部份的RNA序列也可以造成植物對於病毒的抗性，甚至可將多種病毒的RNA片段構築於同一載體，共同轉殖於植物中，即可造成該植物對於多種病毒的抗性（目前中興大學植物病理學系詹富智助理教授與美國康乃爾大學共同擁有此技術之專利）。而經由後續的研究，終於了解許多轉基因植物抗病毒的分子機制其實即為RNAi之作用，並進而發現RNAi的作用其實在動物與植物多年的演化過程中，已成為對抗病原感染時的一種內生性防禦機制，同時亦在生物體生長、發育、與分化的調控過程中，擔任重要的角色。

　　除了抗病毒機制方面之研究外，RNAi現象對於植物病毒引起植物病徵過程中亦扮演重要角色。由於植物病毒之基因體極為簡單，所攜帶的基因極為有限，因此病毒如何引起植物的病徵表現如嵌紋、黃化、葉片捲曲、變形、植株矮化、叢生等（圖1至4），一直是植物病毒研究中的謎。目前已知寄主的病徵表現與RNAi 作用及其抑制息息相關。RNA病毒進行複製時，會產生雙股RNA的中間產物，而此雙股RNA分子即可誘發植物中的RNAi反應，而造成病毒RNA的降解，所以RNA病毒會演化出對抗RNAi作用的抑制物，例如potyvirus之Hc-Pro蛋白、cucumovirus之2b蛋白等，可抑制植物體內之RNAi防禦作用，而促進病毒RNA的複製。近年藉由RNAi的研究，已經發現許多的RNA病毒基因體中皆帶有RNAi的抑制物，以對抗上述的RNAi內生性防禦機制，而這些病毒所攜帶的RNAi作用抑制物也可抑制其寄主內生性的RNAi作用，進而造成寄主細胞生理或分化作用時的不正常，而造成捲葉、絲狀葉等畸形病徵，因此其本身亦可作為病徵之決定因子；例如番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus）的P19蛋白，可藉由結合siRNA的方式抑制寄主植物之RNAi作用，同時也是該病毒引起植物病徵的原因。

四、RNAi 在病毒病害防治之應用實例
　　早在RNAi的作用機制被了解之前，各國科學家已經在利用前述之"病原衍生抗性"，製作轉基因植物以對抗病毒，只是當時並不知道其實就是RNAi的功勞，許多僅轉殖片段病毒基因體即具有抗病毒性狀的轉殖植物即為RNAi的應用。名稱或許不同（RNAi或PTGS），但本質上之相同的。謹舉近年來較為成功的例子，說明RNAi在病毒病害防治工作中的應用情形︰Waterhouse等人(1998)發現可利用同時接種或轉殖正向與反向的二條RNA分子，或一條可自行折回形成雙股RNA的分子誘導出植物對於馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）的抗病毒性狀。Baulcombe的研究團隊(1999)則報告可用tobravirus或potexviruse的基因體片段誘導RNAi現象並引起植物抗性，但是二者所造成的基因靜默表現型不相同，前者的抗病性可使植物出現恢復現象，但後者則否。Tenllado 與 Diaz-Ruiz (2001)則發現可利用雙股RNA以機械接種或是農桿菌暫時性轉染植物而達到抗病毒病害的目的，其方法適用於Tobamovirus、 Potyvirus、 Alfamovirus 等病毒屬。

　　而在動物及人類病毒疾病方面，RNAi技術亦被廣泛研究，並在幾種病毒疾病上已有較具體之初步成果，包括口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）、C型-肝炎病毒、B型-肝炎病毒、G型-肝炎病毒、甚至造成後天免疫不全症候群（AIDS）之HIV病毒等。其中，應用RNAi技術來對抗HIV病毒之研究更被寄予厚望，因為研究專家證實無論是針對HIV病毒感染細胞所需之病毒-CCR5共同受體-CD4，或針對病毒基因組的gag區域，siRNA都可以有效的將病毒與遭感染細胞的基因"靜默"，抑制HIV病毒的感染與複製能力，而其認為siRNA能在哺乳動物細胞發揮作用，短短的21個核?酸可能是重要原因之一，因為其不會刺激哺乳動物體內產生干擾素，進而破壞siRNA的作用。另外有學者研究在293株人類胚胎腎細胞株中分別轉殖感染HIV-1前病毒DNA，以及其對應之siRNA，結果顯示HIV-1前病毒DNA 的表現受到明顯之抑制。但在細胞內siRNA可以持續多久？是否能在細胞間傳播？抑制HIV病毒感染與複製的能力有多強？仍是目前持續被研究的重點。

五、RNAi與寄主基因體功能之研究
　　除了上述在病毒病害防治之應用外，亦可結合RNAi與病毒而應用於寄主基因體功能之研究。由病毒誘導之基因靜默作用（virus-induced gene silencing, VIGS）是目前新發展的高專一性RNA降解研究技術，已被應用於寄主基因之功能性分析。此技術係利用病毒為載體而表達與某個寄主基因核酸序列相同的RNA片段，藉由其所引發的RNAi造成該基因mRNA降解而抑制其表現。VIGS方法具有快速、高效率、高專一性的特點，極為適合作為高通量功能性基因體分析之工具。例如Baulcombe等人將菸草脆裂病毒（Tobacco rattle virus）發展為載體，並證實此系統確能應用於誘發RNAi以破壞特定寄主基因功能，甚至可到達寄主植物之頂芽生長點產生作用。國內中興大學生物科技研究所徐堯煇教授所領導的研究團隊目前正發展以竹嵌紋病毒（圖）衛星核酸為載體的VIGS分析系統，並應用此系統於菸草（Nicotiana benthamiana）中尋找參與竹嵌紋病毒生活史中的寄主因子，期能藉由此系統之發展與應用，更深入明瞭Potexvirus屬病毒與其寄主植物之分子與細胞層次之生物功能。

六、RNAi 目前的缺點與限制
　　RNAi目前仍有下列缺點及限制待克服︰
(一)RNAi並不一定有效，且其效能通常與siRNA的表現量息息相關，在早期的研究中，經常發現僅有不到1%的轉殖植物可表現出基因靜默現象，故其仍有極大改進空間。

(二)由於RNA易被RNA?分解，因此不論是生物合成還是化學合成，成本較高且費時，同時轉染時通常僅是暫時狀態之表現，最長也不過數天，此可能將限制RNAi技術的廣泛應用。

(三)RNAi作用的專一性極高，因此僅能對於RNA序列相似度極高的病毒具有效力，而對於同一屬卻不同種的病毒通常是無效的。

(四)設計或選擇用於誘導RNAi作用的病毒基因體片段，並無明確的規則可循，不同序列長度與在基因體中的相對位置經常導致極為不同的結果。

七、結語
　　RNAi現象被發現至今不超過20年，其作用原理與機制仍未被完全理解，但無疑其亦是一種生物演化途徑，對特定生物體可能具有重要的意義，包括適應外在環境的改變、基因表達調控、防止外來病毒感染及保護基因組等。RNAi技術之應用，目前在功能性基因體學與病毒病害防治之研究方面均產生重大之貢獻。隨著科學家們逐漸掌握RNAi作用的分子機制與其奧妙之處，在可預見的未來中，RNAi科技必將持續為我們解開更多生命的奧秘，並終能針對"無藥可醫"的病毒病害開創出有效防治的康莊大道。

siRNA Lentivirus如何感染細胞?

1. Thaw the recombinant retrovirus or lentivirus supernatant in a 37°C waterbath andremove it from the bath immediately when thawed.