Comet Assay的發展
<基因毒性的評估>
早期: 染色體變異(chromosomal aberration, CA) 、姐妹染色體交換(sister chromatid exchange, SCE) 、 微核(micronuclei, MN)等方法來評估致癌物質暴露所導致的基因傷害◦<低靈敏度及費時>
Ostling以及Jahanson在1984年發現將DNA嵌入低熔點的洋菜膠進行電泳，將會依DNA所受到的傷害程度呈現不同的圖形◦其圖形類似彗星，故名彗星試驗彗星試驗又稱單一細胞膠體電泳(comet assay/single cell gel electrophoresis)，其具有定量性、簡易性與高靈敏度◦因此，彗星分析法成為試驗DNA傷害程度時常用的方法◦
<原理>
單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis Assay)是一種快速、 簡易性、及高靈敏度檢測各別細胞DNA受損的方法(Singh et al., 1988)◦結合傳統生物化學的技術，並利用細胞在膠體電泳的分析下，偵測DNA單股斷裂﹔斷裂之DNA會移出細胞外，形成拖尾的現象﹔若細胞DNA未損害則移動慢且會留在核質體內◦
<廣泛應用>
環境毒理中對DNA損壞作用的分析﹔
1. 如紫外光、電離輻射、 氧自由基等因素造成的DNA受損
2. 細胞凋亡
3. 抗癌藥物的藥物毒理學研究
4. 遺傳毒理學研究(取代傳統UDS分析)
5. 腫瘤治療的跟蹤監測
<特點>
1. 統計分析
2. 每個檢體只要<10,000即可做分析
3. 偵測DNA受損的靈敏度高
4. 適用各種試驗的細胞
細胞處理:
彗星分析法是設計用來評估單一個細胞DNA受損的情形，所以只要是細胞皆可做彗星分析試驗樣品須使用新鮮樣品，且須在4℃ 下製備，以避免細胞大量死亡◦每片CometSlide最佳細胞數為500~1000個(75ul)，是觀察彗星影像的最佳條件◦
細胞來源:
溶於無Ca++及Mg++的PBS懸浮細胞: 取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBSmedium會干擾agarose的附著能力
貼附型細胞:刮取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBS
組織細胞: 剪碎細胞取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBS
對照組細胞準備:
100 uM hydrogen peroxide 20分/ 4℃
25 uM KMnO4 20分/ 4℃
注意事項
(1)必須避光避免UV所造成DNA受損
(2)PBS(Ca Mg free)先預冷至4度C，以抑制細胞在準備過程中內源性酵素的損害或抑制repair反應
(3)每片CometSlide最佳細胞數為500~1000個，是觀察彗星影像的最佳條件
50ul 1x105/ml Cells 500ul LMAgrose è~700 Cells/75ul 5000 Cells
分離膠的製作
彗星分析法是設計用來評估單一個細胞DNA受損的情形，所以細胞間必須能分開，才能進行評估（傳統方法製作分離膠要平穩，以避免DNA位於不同水平面而產生模糊的彗星影響）< span>提供獨特的CometSlide可快速分析DNA受損>
CometSlide是Trevigen的熱門商品
表面具有獨特的Teflon設計 提供客戶直接將細胞/低熔點agarose加入CometSlide上CometSlide節省實驗的時間可排除因繁瑣步驟所造成實驗變異
浸泡溶解緩衝液
目的在去除細胞膜及核膜極大部份的蛋白質，同時將DNA雙股斷裂展開形成單股斷裂，以增加分析的敏感性◦（傳統方法溶解緩衝液的濃度、酸鹼值及浸泡時間等因素會影響細胞的溶解程度）< span>提供最佳化的Alkaline Lysis可提高分析靈敏度>（浸泡溶解緩衝液，可將殘留部份的鹽類中和，因為殘留在DNA的部份鹽類，會中和ＤＮＡ的磷酸根，進而抑制ＤＮＡ的電泳情形◦）
電泳DNA單股斷裂，可因為電泳槽中電極的驅使而自DNA團塊中被拖引出來，經由適當的染劑染色後，在螢光顯微鏡下可以看見很像彗星的影像◦
< span>提供SYBR green染色或銀染 將彗星影像最佳化呈現>
可選擇電泳方式: 1xTBE Buffer or alkaline electrophoresis solution (二擇一) Alkaline electrophoresis : 靈敏度高且可偵測微量的DNA損傷(單股DNA斷裂、雙股DNA斷裂、AP-site缺失(gamma irradiation) ◦電泳設定為低安培下電泳延長為40分
影像分析與計算
隨機選取至少75個彗星影像，於螢光顯微鏡下觀察並照相，並計算尾部長度百分比(％ of tail lenghth)、尾部亮度百分比 (％ of tail lenghth)、尾部動量
(tail moment)等參數
尾部DNA長度 (tail lenghth, TL) = 彗星影像全長-頭部區域長度
尾部區域長度百分比(％ of tail lenghth, %TL)= ( 尾部DNA長度/彗星影像全長 ) x100
尾部亮度百分比 (％ of tail intensity, %TI) = [(彗星影像總亮度和-頭部區域亮度)/彗星影像總亮度和]x100尾部動量 (tail moment, TM) =尾部長度百分比x 尾部亮度百分比
原廠連結: http://www.trevigen.com/
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