【Comet彗星分析套組】#K4350-50單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis Assay)是一種快速、簡易性、及高靈敏度檢測各別細胞DNA受損的方法 @ 太鼎生物科技/太鼎食安科技

-------Comet 彗星分析套組----------------

Comet彗星分析套組

彗星分析方法，可直接觀察單一細胞DNA損傷的程度。是一種快速、簡易性、及高靈敏度檢測各別細胞DNA受損的方法(Singh et al., 1988) 應用電泳設備，即可進行分析◦
(見玻片電泳之部份)

-------Comet彗星分析套組--

—原理介紹---

單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis Assay)是一種快速、簡易性、及高靈敏度檢測各別細胞DNA受損的方法(Singh et al., 1988)◦結合傳統生物化學的技術，並利用細胞在膠體電泳的分析下，偵測DNA單股斷裂﹔斷裂之DNA會移出細胞外，形成拖尾的現象﹔若細胞DNA未損害則移動慢且會留在核質體內◦

—產品應用---

-------環境毒理中對DNA損壞作用的分析----------

1.如紫外光、電離輻射、氧自由基等因素造成的DNA受損

2細胞凋亡

3.抗癌藥物的藥物毒理學研究

4.遺傳毒理學研究(取代傳統UDS分析)

5.腫瘤治療的跟蹤監測

—產品特點---

1.
統計分析

2.
每個檢體只要<10,000即可做分析

3.
偵測DNA受損的靈敏度高

4.
適用各種試驗的細胞

-------Comet 彗星分析套組實驗注意事項----------------

細胞處理/來源/準備---

細胞處理:

彗星分析法是設計用來評估單一個細胞DNA受損的情形，所以只要是細胞皆可做彗星分析試驗樣品須使用新鮮樣品，且須在4℃ 下製備，以避免細胞大量死亡◦每片CometSlide最佳細胞數為500~1000個(75ul)，是觀察彗星影像的最佳條件

細胞來源:

溶於無Ca++及Mg++的PBS懸浮細胞: 取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBSmedium會干擾agarose的附著能力

貼附型細胞:刮取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBS

組織細胞: 剪碎細胞取1 x 105 c ells/ml於預冷的1xPBS

對照組細胞準備:

100 uM hydrogen
peroxide 20分/ 4℃

25 uM
KMnO4
20分/ 4℃

注意事項

(1)必須避光避免UV所造成DNA受損

(2)PBS(Ca Mg
free)先預冷至4度C，以抑制細胞在準備過程中內源性酵素的損害或抑制repair反應

(3)每片CometSlide最佳細胞數為500~1000個，是觀察彗星影像的最佳條件

50ul 1x105/ml
Cells 500ul LMAgrose è~700 Cells/75ul 5000 Cells

—分離膠製作---

分離膠的製作

彗星分析法是設計用來評估單一個細胞DNA受損的情形，所以細胞間必須能分開，才能進行評估（傳統方法製作分離膠要平穩，以避免DNA位於不同水平面而產生模糊的彗星影響）< span>提供獨特的CometSlide可快速分析DNA受損>。

CometSlide是Trevigen的熱門商品，表面具有獨特的Teflon設計提供客戶直接將細胞/低熔點agarose加入CometSlide上CometSlide節省實驗的時間可排除因繁瑣步驟所造成實驗變異。

浸泡溶解緩衝液

目的在去除細胞膜及核膜極大部份的蛋白質，同時將DNA雙股斷裂展開形成單股斷裂，以增加分析的敏感性◦（傳統方法溶解緩衝液的濃度、酸鹼值及浸泡時間等因素會影響細胞的溶解程度）< span>提供最佳化的Alkaline Lysis可提高分析靈敏度>（浸泡溶解緩衝液，可將殘留部份的鹽類中和，因為殘留在DNA的部份鹽類，會中和ＤＮＡ的磷酸根，進而抑制ＤＮＡ的電泳情形◦）

—玻片電泳---

電泳DNA單股斷裂，可因為電泳槽中電極的驅使而自DNA團塊中被拖引出來，經由適當的染劑染色後，在螢光顯微鏡下可以看見很像彗星的影像◦提供SYBR green染色或銀染
將彗星影像最佳化呈現>

可選擇電泳方式: 1xTBE Buffer or alkaline electrophoresis solution (二擇一) Alkaline electrophoresis : 靈敏度高且可偵測微量的DNA損傷(單股DNA斷裂、雙股DNA斷裂、AP-site缺失(gamma irradiation) ◦電泳設定為低安培下電泳延長為40分。

---------------Comet 彗星分析影像分析--------------------

—影像分析與計算---

影像分析與計算

隨機選取至少75個彗星影像，於螢光顯微鏡下觀察並照相，並計算尾部長度百分比(％ of tail lenghth)、尾部亮度百分比 (％ of tail lenghth)、尾部動量(tail moment)等參數

尾部DNA長度 (tail lenghth, TL) = 彗星影像全長-頭部區域長度

尾部區域長度百分比(％ of tail lenghth, %TL)= ( 尾部DNA長度/彗星影像全長 ) x100

尾部亮度百分比 (％ of tail intensity, %TI) = [(彗星影像總亮度和-頭部區域亮度)/彗星影像總亮度和]x100尾部動量 (tail moment, TM) =尾部長度百分比x 尾部亮度百分比

---------------相關產品選擇---------------------

銀染染色套組

銀染染色套組Silver Staining Kit
Catalog #	Product Name	Size
4251-050-K	CometAssay® Silver (CometAssay Kit w/silver staining reagents)	50 samples
4254-200-K	CometAssay® Silver Staining Kit	200 samples

水平電泳槽設備 NT$8500 (限量買完為止)

彗星分析可以應用一般水平電泳槽，來完成DNA拖尾。建議使用Mupid-2電泳槽進行彗星分析玻片電泳。其水平電泳之設定，為10分鐘設定，依細胞種類之不同，電泳的時間需再調整。

Mupid-2電泳槽資料如下所示: http://tw.myblog.yahoo.com/taiding2000/article?mid=124

電泳時間最佳化，為1V/com。建議以300V可調式電泳供應器調整福特數為20V，10分鐘電泳。

300V可調式電泳供應器資料如下所示: http://tw.myblog.yahoo.com/taiding2000/article?mid=118

Trevigen彗星分析專用電泳槽

Trevigen公司提供之彗星分析專用電泳槽，讓彗星分析方法最佳化。克服彗星試驗結果中之操作變異，例如電泳溫度，電極間距離及緩衝之高度所造成之變數。

儀器特點

◾具有冷却chamber保持緩衝液溫度之恆定。一體成型的塑料體。

◾保持最佳的緩衝液水平高度，使玻片電泳結果重覆性高。

◾特別設計的托盤，可容納2，20和96之彗星玻片。在電泳過程中保持正確的位置。

◾進行CometAssay最佳化

彗星分析專用電泳槽相關資料如下所示: http://tw.myblog.yahoo.com/taiding2000/article?mid=1103&prev=-1&next=1100

SCIE-PLAS彗星分析專用電泳槽NT$30,000

Comet single cell
gel electrophoresis systems

SCIE-PLAS公司提供之彗星分析專用電泳槽，讓彗星分析方法最佳化。可接冷却循環機，使電泳溫度保持於4度C。克服彗星試驗結果中之操作變異，例如電泳溫度，電極間距離及緩衝之高度所造成之變數。

儀器特點

◾外接冷却循環機，保持緩衝液溫度之恆定。

◾保持最佳的緩衝液水平高度，使玻片電泳結果重覆性高。

◾具有致冷之玻片置放台面，可容納標準玻片20片和40片之彗星玻片置放。在電泳過程中保持正確的位置。

◾具有避光設計，進行CometAssay最佳化

彗星分析專用電泳槽相關資料如下所示:
http://tw.myblog.yahoo.com/taiding2000/article?mid=1105